木质素和肽促进稻田土壤中砷甲基化微生物的丰度和活性
LigninandPeptidePromotetheAbundanceandActivityofArsenicMethylationMicrobesinPaddySoils
作者：Si-YuZhang等
期刊：EnvironmentalScience & Technology
影响因子：10.9
DOI：10.1021/acs.est.4c10809
文章摘要
水稻直穗病是由微生物介导的砷甲基化引起的，并且通常在水稻土中区域性分布活性肽。然而，含甲基化基因（arsM）微生物群落地理分布的生物地球化学机制尚不清楚。本文揭示了中国不同区域水稻土arsM群落在整个大陆尺度上存在显著差异（p=0.001）。此外，arsM群落多样性与土壤溶解有机质（DOM）化学多样性呈正相关。在不同的DOM组分中，木质素和肽类DOM是影响arsM群落丰度和多样性的最重要DOM组分。对18个选定的水稻土样品的宏转录组分析表明，arsM基因的表达量随土壤木质素和肽类含量的增加而增加。与对照相比，添加木质素和肽显著（p<0.05）提高了培养水稻土中甲基化砷的浓度。在木质素和肽含量相对较高的水稻土中，含有arsM基因的菌群主要属于Chloroflexota、Verrucomicrobiota、Deltaproteobacteria、Thermodesulfobacteriota和Ignavibacteriota。本研究揭示了水稻土中DOM多样性与arsM菌群之间的相关性，为土壤砷污染控制和水稻可持续生产提供了机制信息。
主要研究结果
1. 中国水稻土的土壤性质和DOM成分
分别采集了来自中国北部（n=21）、东部（n=42）、中部（n=42）和南部（n=36）四个地区的共141个水稻土样品（图1A）活性肽。不同地区的土壤pH值和砷含量差异显著（p<0.05）（图1B）。总有机碳含量（TOC）范围为5.81至45.29g/kg，不同地区之间没有显著差异（p>0.05；图1B）。不同区域土壤DOM以肽类、脂质类、木质素类和单宁类成分为主，平均分别占总DOM的29.4%、28.9%、19.3%和15.2%（图1C），且主要受土壤pH、TOC、TN和TS的影响。土壤重金属（类）含量与土壤DOM化学多样性的相关性（图1D）表明，水稻土中As是最重要的因素，其与土壤DOM丰富度（Chao1）、Shannon和Simpson多样性指数均呈显著（p<0.001）负相关。
图1.采样地点、土壤特性和DOM成分的特征
2. ArsM群落的转录活性及其与DOM含量的相关性
在DNA水平上，水稻土中arsM基因的相对丰度范围为每个细胞2.12至4.07个拷贝活性肽。在中国南部（平均每个细胞3.27个拷贝）和中部（平均每个细胞3.20个拷贝）水稻土中检测到的arsM基因丰度显著高于中国东部（平均每个细胞3.04个拷贝，p<0.01）和北部（平均每个细胞2.86个拷贝，p<0.001）水稻土。在中国南部和中部水稻土中，表达的arsM基因（在RNA水平上）的相对丰度也高于中国东部和北部水稻土（图2A）。DNA（图2B）和RNA水平（图2C）上arsM基因的相对丰度均与土壤中木质素和肽类DOM成分的含量呈显著（p<0.05）正相关。为了进一步验证木质素和肽类DOM成分对arsM群落的影响，从山东、浙江、湖南、广东和云南省采集了18个水稻土样品，并进行了宏转录组学分析（图2D）。转录的arsM基因相对丰度与土壤木质素类（R2=0.31）和肽类DOM成分（R2=0.27）含量呈显著（p<0.05）正相关，而土壤单宁类DOM成分含量与转录的arsM基因相对丰度呈显著（p<0.01）负相关（R2=0.36）。对于其他主要的DOM结构，如氨基糖类、碳水化合物类和脂质类成分，其含量与转录的arsM基因相对丰度之间没有显著相关性（p>0.05；图2E）。
图2. DNA和RNA水平上arsM基因的相对丰度及其与DOM含量的相关性
3. ArsM群落的多样性及其与土壤DOM成分的相关性
NMDS分析显示，不同地区水稻土的arsM群落存在显著差异（图3A；PERMANOVA，p<0.001）活性肽。从宏基因组数据集中，我们筛选出80个细菌MAG和10个古菌MAG，其完整性≥90%，污染≤5%。细菌MAG主要被归类为Pseudomonadota、Acidobacteriota、Chloroflexota、Actinobacteriota和Bacteroidota，古菌MAG主要被归类为Nitrososphaerota，其中约67%的细菌MAG携带arsM基因。
在中国各地水稻土中，arsM群落的相似性与DOM组成之间存在显著（p<0.001）正相关（R2=0.03；图3B）活性肽。在DOM组分与arsM群落的显著相关性方面，木质素、肽和脂质类组分是主要的DOM组分，占arsM群落与DOM组分之间观察到的总体显著正相关的80.1%。具体而言，水稻土中木质素以及肽类DOM组分的相对丰度与Pseudomonadota、Deltaproteobacteria、Bacillota、Chloroflexota、Nitrospirota、Thermodesulfobacteriota、Verrucomicrobiota以及环境样品中尚未分类和命名候选菌种的各种未培养细菌的丰度呈显著（p<0.05）正相关（图3C）。不同的DOM（主要为木质素和肽类组分）也与古菌arsM群落的相对丰度呈显著（p<0.05）正相关。
图3. arsM多样性及其与DOM的相关性
4. 影响ArsM丰度和多样性的因素
随机森林分析表明，在所有变量中微生物多样性、N、C和S代谢基因相对丰度、土壤pH、As含量以及木质素和肽类DOM组分含量是导致arsM群落丰度和多样性变异的最重要因素（图4A）活性肽。进一步采用偏最小二乘结构方程模型（PLS-SEM，拟合优度为0.46）描述影响arsM群落多样性的重要变量之间的直接和间接相互作用途径，该模型解释了中国水稻土arsM群落总变异的46%（图4B）。总体而言，微生物多样性和元素代谢基因丰度是对arsM群落多样性贡献最大的因素，分别具有最大的总正效应和负效应（图4C）。土壤性质（TOC和TN）和微生物群落多样性直接影响arsM群落多样性，其正向路径效应分别为0.20和0.71，达到显著（p<0.05）。而代谢群落中元素相对丰度（C、N、S和P）对arsM群落多样性具有显著（p<0.05）的负向影响。土壤pH和As含量主要通过间接影响微生物群落多样性或功能基因丰度来影响arsM群落的变异。在DOM组分中，土壤木质素类组分含量通过直接影响元素代谢群落的相对丰度进而影响arsM群落多样性，而肽类组分含量通过直接影响整个微生物群落多样性进而影响arsM群落多样性。木质素类成分含量也显著（p<0.05）直接影响土壤砷含量，并且对arsM多样性的影响总体上大于肽含量（图4C）。
图4. 随机森林和PLS-SEM分析
5. 木质素和肽促进活性肽了水稻土中ArsM基因的转录丰度以及增强了砷甲基化
选取部分稻田土壤样品进行培养试验，并添加木质素和肽活性肽。结果标明，甲基化砷（包括MMA和DMA）的浓度在培养第0天至第7天期间呈上升趋势（图5A），并在培养7天后逐渐下降，这可能是由于甲基化为挥发性三甲基胂（TMA）或脱甲基化为无机砷所致。添加木质素和肽后，甲基化砷的浓度高于未添加DOM的对照组。木质素处理组的甲基化砷浓度在第3天和第7天（图5A）均显著高于肽添加组（双侧t检验，p<0.05）。为了探究木质素和肽类物质如何影响土壤中arsM基因转录活性和微生物群落，我们选取了第7天砷甲基化效率最高的土壤样品进行RNA水平的arsM基因丰度qPCR分析，并对其进行16SrRNA基因测序以评估土壤微生物多样性。与对照组相比，添加木质素和肽的土壤样品中转录本的丰度均有所增加，且添加木质素的组与添加肽的组存在显著差异（双侧t检验，p<0.05）（图5B）。与对照处理相比，添加木质素也增加了微生物多样性，尽管没有检测到显著差异（双侧t检验，p>0.05；图5C）。然而，在添加肽的组中，微生物多样性显著低于对照组（双侧t检验，p<0.05；图5C）。
图5. 木质素和肽对As(III)甲基化的影响
结论
水稻直穗病在中国及亚洲其他国家的许多稻区普遍发生，其主要原因是微生物介导的砷甲基化作用活性肽。通过对中国水稻土的区域调查，我们发现水稻土DOM组分的多样性与arsM群落多样性呈正相关。在不同的DOM组分中，木质素和肽类DOM的含量是影响arsM群落丰度、活性和多样性的最重要因素。添加木质素和肽类DOM组分后，水稻土中arsM基因转录本丰度和砷甲基化效率的增加进一步证明了土壤木质素和肽类DOM组分含量与arsM基因丰度之间的正相关关系。本研究强调了水稻土DOM组分化学多样性与arsM群落多样性之间的相关性，揭示了木质素和肽类DOM促进水稻土砷甲基化的机制。考虑到有机质施肥（如施用粪肥和秸秆还田）在农业实践中普遍应用，各种DOM成分对As甲基化的可能促进作用不容忽视。
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